ВВЕДЕНИЕ
Амилоиды крайне активно изучаются в настоящее время, прежде всего, в связи с тем, что целый ряд из них имеют важное функциональное значение, а некоторые являются летальными патогенами человека и животных.
В частности, у человека описано около 40 болезнетворных амилоидов. Наиболее распространенными амилоидными заболеваниеми являются диабет второго типа, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Вместе с тем, амилоиды могут быть не только патогенами, но и иметь важную функциональную роль.
Функциональные амилоиды выявлены у высших эукариот (PMEL у человека и CPEB у моллюска Aplysia, а также у ряда бактерий. Примечательно, что у бактерий известно достаточно много амилоидов, выделяемых в различные группы: курлины, чаплины, гарпины и микроцин E-492, но все они являются экстраклеточными. Так, некоторые грамм-негативные бактерии имеют экстраклеточные амилоидные фибриллы, которые индуцируют воспалительный процесс у хозяина и участвуют в связывании бактерии с клеткой хозяина. Другим вариантом экстраклеточных амилоидов являются фибриллы грамм-положительной бактерии Streptomyces coelicolor, которые используются ею для снижения относительной вязкости среды обитания и для формирования воздушных гифов. Микроцин E492 является белковым бактериальным токсином, продуцируемым Klebsiella pneumoniae. Наконец, группа бактериальных амилоидов, называемых гарпинами, вызывает реакцию сверхчувствительности у растений.
Внутриклеточные амилоиды бактерий на данный момент не выявлены. Это связано, прежде всего, с отсутствием на данный момент методов, которые бы позволяли проводить у различных организмов системный поиск белков, обладающих потенциально амилоидными свойствами.
В лаборатории физиологической генетики СПбГУ разработан один из первых методов, позволяющих проводить системный поиск кандидатов на роль амилоид-формирующих белков in vivo в масштабах всего протеома.
Целью настоящей работы является системный поиск внутриклеточных, а также новых экстраклеточных амилоидов у бактерии Escherichia coli. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
Выделить высокомолекулярные белковые фракции, устойчивые к обработке ионными детергентами, из четырех штаммов E. coli и провести анализ их молекулярного состава.
Провести анализ наличия амилоидогенных последовательностей у выявленных белков-кандидатов на роль конститутивных амилоидов.
Проверить возможность формирования выявленными белками фибрилл in vitro при помощи электронной микроскопии, а также кинетику связывания этими фибриллами амилоид-специфичного красителя тиофлавина-T.
Амилоиды и их структура
Амилоидами называют упорядоченные белковые полимеры, которые образуются за счет формирования межмолекулярных β-складчатых структур из мономеров одного и того же белка, которые стабилизированы межмолекулярными водородными связями.
Термин амилоид был введен в 1854 году немецким ученым Рудольфом Вирховым. Используя лучшую научную методологию и медицинские знания того времени, Вирхов применяет йод для окрашивания включений в тканях селезенки, называемых corpora amylacea. Подобные патологические включения описывали ранее, начиная с 1639 года, как «восковую» печень и «белый камень», в селезенке. Когда Вирхов обнаружил, что corpora amylacea окрашивается йодом в бледно-синий цвет и становится фиолетовой при последующем добавлении серной кислоты, он пришел к выводу, что corpora amylacea состоит из целлюлозы или крахмала. Поэтому Вирхов назвал подобные включения амилоидами, то есть крахмалоподобными. Следует уточнить, что в то время различие между крахмалом и целлюлозой было неясно. Когда в 1859 году Фрайдрих и Кекуле показали наличие белка в амилоидах и отсутствие углеводов на фоне высокого содержания азота, внимание было перенесено на изучении амилоида сперва как белка, а затем как целого класса белков, имеющих склонность переходить а конформации, приводящие к образованию фибрилл.
В конце 19-го и начале 20-ого веков, исследования природы амилоидов превратилась из микроскопических наблюдений Вирхова и современников в классификацию клинических симптомов. Термин амилоид был использован для описания конкретных паталогий, наблюдаемых при вскрытии органов и тканей пациентов, страдающих различными клиническими синдромами, которые были впервые классифицируемы как идиопатические (первичные) приобретенные (вторичные) и наследственные (облусловленные генетическими причинами). Также по характеру распространения амилоидных включений амилоидозы разделяют на локализованные и системные.
Первоначальные исследования Коэна и Калкинса показали, что все амилоиды содержат специфический фибриллярный компонент белковой природы. Сейчас известно, что многие белки в определенных нефизиологических условиях, например, in vitro, обладают способностью к амилоидогенезу. Собственно амилоидная фибрилла построена из нескольких протофиламентов. Мономеры, находящиеся в составе протофиламентов, соединены водородными связями между β-слоями, которые ориентированы перпендикулярно латеральной оси протофиламента, образуя так называемую «кросс-β» структуру.
Организация фибрилл амилоидов может быть достаточно разнообразной. Так, по данным нескольких авторов, фибриллы амилоида-β, вызывающего у человека болезнь Альцгеймера, могут формировать до 10 различных вариантов («полиморфов») и обладать двух- или трехсторонней симметрией. Также в настоящий момент достаточно детально изучена тонкая организация дрожжевых амилоидов Sup35, Ure2 и Rnq1. Считается, что β-структуры в таких агрегатах расположены планарно в виде серии слоев, причем β-структуры каждого последующего слоя расположены параллельно и в регистре. Такая организация агрегатов, по-видимому, свойственна целому ряду амилоидов.
Одним из наиболее дискуссионных вопросов является тонкая организация фибрилл приона млекопитающих PrP. Изначально для фибрилл PrP тоже была предложена модель β-спирали. Но более поздние данные, которые были получены с использованием метода электронного парамагнитного резонанса рекомбинантного PrP, выявили, что его фибриллы образованы параллельными и в регистре β-слоями. Этой трактовки организации фибрилл PrP придерживается сейчас большинство исследователей.
Также существуют различные неканонические формы амилоидных агрегатов. Одна из них получила название сферулитов. Это крупные (до нескольких микрометров) агрегаты, образованные радиально ориентированными фибриллами.
Таким образом можно сказать, что для амилоидных агрегатов различных белков характерна упорядоченная организация, которая обусловлена образованием значительного количества бета-слоев, стабилизированных водородными связями. Благодаря этому амилоиды обладают высокой устойчивостью к различным детергентам и системам клеточной деградации белка Амилоид является нековалентным олигомером с межмолекулярными водородными связями между бета-слоями, которые поперечно самоорганизуются, формируя фибриллы. Такую структуру называют кросс-бета, потому что бета-цепи, формирующие бета-слои, ориентированы перпендикулярно оси волокон. Все амилоидные фибриллы имеют характериную дифракционную картину и специфически связываются с красителями конго красным и тиофлавином S / T.
К настоящему времени химический состав и структура амилоидов достаточно хорошо изучены. Для детекции амилоидных включений используют такие красители как конго красный, генциановый фиолетовый, тиофлавин Т или S. При связывании с амилоидами тиофлавина Т возникает характерный сдвиг эмиссии флуоресценции в красную область. При связывании конго красного амилоидные включения окрашиваются в розовый цвет, а в поляризационном фильтре демонстрируют рефракцию яблочно-зеленого цвета. Специфическое связывание конго красного и тиофлавинов свидетельствовало в пользу наличия упорядоченной структуры. Тем не менее, так как амилоидные фибриллы практически не кристаллизуются, подробные исследования их ультраструктуры рентгеновской кристаллографией либо ядерным магнитным резонансом очень затруднительны. Поэтому для физической и структурной характеристики амилоидных фибрилл используют методы относительно низкого разрешения. Так, кросс-бета структура может быть проанализирована с помощью дифракции рентгеновских лучей, кругового дихроизма и преобразованием ИК-спектроскопии по Фурье, которая используются для измерения относительного содержания бета-листов. Электронного парамагнитный резонанс в сочетании с масс-спектрометрией или двумерной спектроскопией ядерного магнитного резонанса, дают возможность более детально изучить структуру амилоидных фибрилл, однако исследования на атомном уровне при помощи этих методов невозможны. В настоящее время построен ряд моделей амилоидных фибрилл, однако все они пока не доказаны.
Амилоиды бактерий
К настоящему времени у бактерий выявлено 4 группы внеклеточных амилоидов: курлины, чаплины, гарпины и микроцины. Внутриклеточные амилоиды у бактерий не идентифицированы, так как не существуют методы, которые позволили бы производить системный поиск амилоидогенных белков в протеоме бактерий.
Бактерии, производящие курлиновые волокна, часто покрываются экзополисахаридами и создают флоккулиты, которые способствуют возникновению биопленок. Курлины также участвуют в поверхностной адгезии, иммунном ответе и в патогенезе. Курлины образуются у E. coli с помощью шести белков, кодирующиеся оперонами csgBA и csgDEFG, которые транскрибируются в разных направлениях. Гомологичные опероны были выявлены у бактерии рода сальмонелла и называются agfBA и agfDEFG.
Спорообразующие нитевидные бактерии Streptomyces coelicolor используют называемые «чаплинами» амилоиды для завершения своего жизненного цикла в биопленках, растущих на границе раздела сред воздух-жидкость. Семейство чаплинов состоит из восьми амфипатических белков (CHPA-H), которые формируют амилоиды, необходимые для снижения поверхностного натяжения воды, что крайне важно для попадания псевдогифов бактерий в воздушную среду и завершения споруляции. Чаплины также образуют гидрофобные слои оболочки бактериальных спор, которые, как полагают, предназначены для оптимизации дыхания.
Гарпины являются вирулентными факторами патогенов растений, таких как Xanthomonas, Erwinia и Pseudomonas. Гарпины вызывают реакцию сверхчувствительности у растения-хозяина. Эта реакция приводит к гибели клеток в локализованной области растительной ткани, необходимой для предотвращения распространения возбудителя. Было показано, что гарпины способны образовать амилоидоподобные волокна in vitro.
Микроцин E492 (MccE492) Klebsiella pneumoniae является токсичным бактерицидным белком, который собирается в олигомерные комплексы, расположенные на внутренней мембране бактериальной клетки. Было показано, что MccE492 формирует потенциал-независимые ионные каналы в плоских липидных бислоях. Молекулярная масса MccE492 – 6 кДа. Токсичность MccE492 меняется в течение цикла роста K. pneumoniae: она наиболее высока в период экспоненциальной фазы и низка в стационарной фазе. K. pneumoniae продуцирует небольшой белок MceB, локализованный на внутренней мембране, который придает ей устойчивость к токсичности собственного MccE49. К сожалению, молекулярный механизм, обуславливающий эту устойчивость, еще не изучен.
Листериолизин из бактерий Listeria является холестерин-зависимым цитолизином, активность которого зависит от рН. LLO формирует поры в мембране фаголизосомы, позволяющей бактерии попасть в цитоплазму хозяина и продолжить свой жизненный.
Методы выявления амилоидов в тканях многоклеточных организмов
Патогенные амилоиды человека часто формируют в тканях крупные депозиты, которые могут быть достаточно легко визуализированы при помощи специфического окрашивания. Способы гистологического окрашивания амилоидов известны достаточно давно. Собственно, первые амилоиды, обнаруженные Р. Вирховом в тканях селезенки человека, окрашивались иодином, что вызвало неверное представление об их молекулярной природе и, собственно, дало начало ошибочному термину «амилоид».
В настоящее время разработан метод, который предназначен для выявления неизвестных амилоидных белков, основанный на анализе молекулярного состава амилоидных депозитов. Биоптаты тканей заключают в FFPE (формалин-фиксирующий парафин). Затем проводят экстракцию в растворе, содержащем 50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 0,2 М ЭДТА и 6,4 М гидрохлорид гуанидина при 37°С в течение 5 дней. Амилоидные белки очищали с помощью ВЭЖХ и идентифицировали секвенированием по Эдману. Образцы, которые не могут быть секвенированы, анализировали при помощи масс-спектрометрии. В последующих исследованиях авторы использовали аналогичный метод, с увеличением времени инкубации до 8-10 дней с ежедневной обработкой ультразвуком для извлечения амилоидных белков из FFPE срезов и идентификации последовательностей при помощи тандемной масс-спектрометрии.
Команда из клиники Майо впервые использовала метод лазерной микродиссекции (РМР) для захвата амилоидных депозитов из слайдов FFPE, с последующей масс-спектрометрической идентификацией. Для извлечения используют умеренное количество раствора, содержащего 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,0002% Zwittergent3-16 и сокращают время экстракции до 90 минут при 98°С, после чего обработывают пробы ультразвуком в течение 60 минут. После расщепления трипсином, пептиды анализируют тандемной масс-спектрометрией. Следует отметить, что все перечисленные методы пригодны лишь для идентификации амилоидов многоклеточных, формирующих крупные депозиты.
Методы поиска амилоидов у одноклеточных организмов
Спецификой амилоидов большинства одноклеточных является то, что они не образуют крупных депозитов. Вместе с тем, экстраклеточные амилоиды бактерий как раз являются мажорным компонентом поверхности бактериальной клетки и могут быть относительно легко идентифицированы путем смывания в раствор с последующим осаждением и масс-спектрометрической идентификацией.
Достаточно широко исследована группа инфекционных амилоидов дрожжей Saccharomyces cerevisae – прионов. Прионы – белки, которые могут существовать в двух или более конформациях в, одинаковых физиологических условиях, и как минимум одна из этих конформаций обладает инфекционными свойствами. На сегоднящний день есть два основных подхода для идентификации новых прионов. Первый подход базируется на методе с использованием генов, которые слиты с последовательностями GFP или SUP35MC, с последующим определением инфекционности, амилоидных свойств и поиском фенотипического проявления у выявленных прионов. Второй подход, «от фактора к гену» применяется, если есть некий сходный по свойствам с прионом нехромосомный детерминант. В этом случае проводят масштабные генетические скрининги с использованием экспрессионных или делеционных библиотек. Оба подхода обычно очень трудоемки, требуют значительных временных затрат и не гарантируют идентификацию искомого амилоида.
Штаммы и условия культивирования E. Coli
Использованные в работе штаммы E. coli перечислены в таблице. Бактерии культивировали в жидкой среде LB без добавления антибиотиков при 37°C.
Штаммы E. coli, использованные в работе.
Штамм
Генотип
Источник
DH5α
supE44 ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
Hanahan, 1985
Rosetta
F- ompT hsdSB(RB- mB-) gal dcm λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 ind1 sam7 nin5]) pLysSRARE (CamR)
“Novagene” (США)
XL-Blue
endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)
“Stratagene” (США)
BL21
F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(λS)
“Stratagene” (США)
Выделение белковых фракций, обогащенных амилоидами
Для выделения белковых фракций, обогащенных амилоидами (ДВФ) бактерии выращивали в течение ночи на чашке с твердой средой LB без добавления антибиотиков, после чего приблизительно 107 клеток инокулировали в 10 мл жидкой среды LB и выращивали еще в течение 12 часов при 37°C. Клетки отмывали от среды в 100 мл буфера TBS (pH 7,5). В буфер добавляли 10 мМ дитиотрейтол и 5 мМ фенил-метил-сульфонил-фторид. Далее разрушали клетки с помощью пятикратного повторения замораживания при -70°C в течение 10 минут с последующим оттаиванием в водяной бане при 30°C в течение 5 минут. Клеточный дебрис удаляли центрифугирование при 3000g, 4°C в течении 5 минут. Надосадочную фракцию переносили в новую пробирку и доводили объем до 5 мл буфером TBS. Полученную суспензию наслаивали на 1 мл 25% раствора сахарозы в TBS и осаждали ультрацентрифугированием в течение 2 часов (160000g, 4°C). Полученную осадочную фракцию ресуспендировали в 4 мл TBS, обрабатывали РНК-зой-А (“Thermo Scientific”, США) в течение 15 мин при комнатной температуре и затем 3% лаурил-саркозинатом натрия («Хеликон», Россия) или 1% додецил-сульфатом натрия («Хеликон», Россия) в течение 5 минут, также при комнатной температуре. Полученный раствор наслаивали на 1 мл 25% раствора сахарозы в TBS с добавлением 0,3 % лаурил-саркозината натрия или 0,1 % SDS и осаждали в течение 8 часов, 160000g, 4°C (или 16°C, если в качестве детергента был использован SDS, так как он выпадает в осадок при 4°C). Осадочную фракцию, которая получалась в результате ультрацентрифугирования, дважды отмывали в 5мл TBS с добавлением 0,05% TWEEN-20 (“Promega”, США), каждый раз осаждая ДВФ в течение двух часов при 160000g, 4°C. Полученные ДВФ хранили при -70°C предварительно подсушив при помощи водоструйного насоса.
Разделение белков
Выделенные из E.coli ДВФ растворяли в буфере, содержащим хаотропные агенты (8M мочевина, 2M тиомочевина, 4% CHAPS (все производства “Sigma”, США) и 30 mM TrisHCl pH 8,5), и инкубировали в течение двух часов при комнатной температуре. Далее суспензию центрифугировали при 12500g в течение 20 минут и разделяли на осадок и надосадочную фракцию. К осадку добавляли объем буфера равный объему отобранной надосадочной фракции и ресуспендировали. Далее к обеим полученным пробам добавляли одну треть объема стандартного четырехкратного буфера для нанесения на ПААГ (40% глицерол, 240 мМ TrisHCl pH 6,8, 8% SDS, 0,04% бромфеноловый синий, 5% бета-меркаптоэтанол) и кипятили в течении 10 минут. Полученные белковые пробы разделяли при помощи стандартного SDS-PAGE в камерах для гель-электрофореза “Mini-PROTEAN 3 Cell” или “Protean XL Cell” производства “Bio-Rad” (Италия) при напряжении 180В и 200В, соответственно, и со стабилизацией силы тока по напряжению. Использовали 12% разделяющий гель. Для определения приблизительной массы белков применяли маркер молекулярного веса “Spectra” “Thermo Scientific” (США). Гели окрашивали красителем кумасси бриллиантовым синим производства “Promega” (США).
Идентификация белков
Для идентификации полосы, содержащие белок, вырезали из геля и отмывали от кумасси в 1 мл дистиллированной воды. Идентификацию белков проводил ресурсный центр «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ при помощи тандемного времяпролетного масс-спектрометра с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией “Bruker Ultraflextrime” (“Bruker Daltonics”, Германия). В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту. Пики генерировались при помощи программного обеспечения “flexAnalysis 3.2” (“Bruker Daltonics”, Германия). Для поиска и идентификации белков использовали программное обеспечение “Mascot” 2.4.2 (“Matrix Science”, http://www.matrixscience.com) и базу данных “NCBI” (США).
Выделение и анализ высокомолекулярных фракций, устойчивых к обработке ионными детергентами из E. coli
Нами проведены выделения ДВФ из четырех штаммов E. coli (DH5α, Rosetta, XL-Blue и BL21) с использованием лаурил-саркозината натрия в качестве детергента. Сразу четыре штамма использованы в данной работе для того, чтобы исключить возможность артефактов, а также проанализировать возможность вариабельности молекулярного состава ДВФ, выделенных из штаммов с разным генотипом и, в некоторых случаях, происхождением (так, DH5α происходит от штамма K-12, а BL21 от штамма дикого типа E.coli B). Выделенные ДВФ обработаны буфером, содержащим хаотропные агенты, и разделены на две фракции: растворимую и нерастворимую в данном буфере. Белки из обеих фракций денатурированы кипячением в стандартном SDS-PAGE буфере для нанесения и разделены при помощи одномерного гель-электрофореза. Полученные гели окрашены кумасси бриллиантовым синим. Следует уточнить, что эксперимент был проведен в двух повторностях, при этом разделение белков выполняли в двух типах камер для гель-электрофореза: маленького размера (“Mini-PROTEAN 3 Cell”) и большого (“Protean XL Cell”).
Детергент-устойчивые высокомолекулярные белковые фракции из E. coli. а – из штаммов DH5α и XL-Blue; б – из штаммов BL21и Rosetta; в – то же, что и б, гель увеличенного размера, максимальная загрузка проб. Мр – маркер молекулярного веса; DH – штамм DH5α; XL – штамм XL-Blue; BL – штамм BL21; RS – штамм Rosetta; Н – фракции, нерастворимые в хаотропных агентах, Р – растворимые. Цифрами обозначен вес фрагментов маркера молекулярного веса.
Как видно из рисунка, в целом, распределение полос достаточно сходно для всех четырех проанализированных штаммов. Вместе с тем, наблюдаются и вариабельные полосы в области 65 кДа. В целом, количество белка, выделенное из штаммов DH5α и XL-Blue существенно ниже, чем из BL21и Rosetta, хотя во всех четырех штаммах присутствуют мажорные полосы в области 35-40 кДа. Одним из недостатков используемого подхода является то, что концентрации белков не могут быть точно выравнены перед нанесением (т.к. одна из фракций до кипячения нерастворима). В связи с этим, единственным способом приблизительного выравнивания концентраций анализируемого белка является выравнивание количества бактериальных клеток, из которых производится выделение и аккуратность при проведении выделения. Выявленные на геле полосы были вырезаны, отмыты от кумасси и переданы на идентификацию. В настоящее время проведена идентификация белков из геля, изображенного на Рисунке 1.а. Идентификация белков, вырезанных из гелей 1.б-в сейчас проводится. Также мы провели выделение высокомолекулярных белковых фракций из тех же четырех штаммов E. coli с использованием SDS вместо саркозината натрия.
Выводы
Устойчивые к обработке лаурил-саркозинатом натрия высокомолекулярные белковые фракции E. coli образованы рядом белков с различной молекулярной массой.
Наиболее мажорными белками в составе данных фракций являются белки наружной мебраны OmpA и OmpC, а также Дигидропоиллизин-ацетилтрансфераза пируват-дегидрогеназного комплекса aceF.
Все идентифицированные белки содержат амилоидогенные участки, выявляемые алгоритмом “Waltz”.
Перспективы исследования
На следующем этапе данного исследования будет проведено разделение при помощи SDS-PAGE и масс-спектрометрическая идентификация потенциально амилоидогенных белков из четырех штаммов E. coli, выделенных при помощи SDS вместо саркозината натрия. Также мы планируем провести биоинформатический анализ наличия амилоидогенных последовательностей у выявленных белков. На финальном этапе работы для одного или нескольких из выявленных белков будет проверена возможность формирования фибрилл in vitro при помощи электронной микроскопии и также кинетика связывания этими фибриллами амилоид-специфичного красителя тиофлавина-Т, что позволит сделать заключение об их амилоидных свойствах.
